Ферменты выполняют в организме почти всю химическую работу. Одни помогают клеткам получать энергию, другие копируют и восстанавливают ДНК, третьи расщепляют токсины или передают сигналы. Биологи давно пытаются приспособить белковые молекулы для новых задач, от редактирования генов до лечения болезней. Однако изменить фермент гораздо труднее, чем может показаться. Несколько замен в цепочке аминокислот способны нарушить форму белка и полностью лишить его активности.
Обычно учёные берут природный фермент, который хотя бы отдалённо напоминает нужный инструмент, и запускают направленную эволюцию. В белок вносят случайные мутации, затем проверяют получившиеся варианты и оставляют наиболее удачные. Лучшие молекулы отправляют в следующий цикл. После множества повторений фермент может начать быстрее проводить реакцию, распознавать новую мишень или точнее воздействовать на определённый участок белка.
Работа требует времени и ресурсов, а успех во многом решает исходная молекула. Природные ферменты приспособлены к задачам, которые возникли в ходе эволюции живых организмов. Запаса прочности для радикальной лабораторной переделки у них часто нет. Полезные мутации постепенно накапливаются, но вместе с ними белок теряет устойчивость, хуже сворачивается и в какой-то момент перестаёт работать.
Новый подход меняет саму отправную точку. Вместо природного фермента исследователи сначала создали его более устойчивую версию с помощью искусственного интеллекта, а уже затем отправили белок на направленную эволюцию. Проверку провели на протеазах ботулинического нейротоксина. Протеазы разрезают другие белки в строго определённых местах и действуют как молекулярные ножницы. Ботулинический нейротоксин блокирует передачу сигналов от нервов к мышцам и вызывает паралич. Очищенные формы вещества применяют в препаратах на основе ботулотоксина, включая ботокс.
Для перестройки ферментов выбрали модель ProteinMPNN. Алгоритм получает трёхмерную форму белка и подбирает аминокислотную последовательность, которая способна принять ту же конфигурацию. Модель сохраняет общую архитектуру молекулы, но заменяет отдельные аминокислоты, чтобы белок лучше сворачивался и дольше оставался стабильным.
ProteinMPNN предложила 58 вариантов протеазы. По расчётам каждый из них должен был превосходить природный фермент по устойчивости. Из списка выбрали три наиболее перспективные последовательности и загрузили соответствующие генетические инструкции в бактерии Escherichia coli. Бактерии произвели новые белки, после чего исследователи проверили их растворимость и активность.
Все три протеазы хорошо растворялись внутри клеток и почти не слипались. Несколько вариантов разрезали белковые мишени активнее природных аналогов. Высокая растворимость играет важную роль: нестабильный белок легко теряет правильную форму, после чего открытые участки молекул сцепляются друг с другом и образуют неработающие скопления. Устойчивый фермент дольше сохраняет структуру и переносит больше мутаций.
Три переработанные протеазы отправили в систему PACE, или фаг-ассистированную непрерывную эволюцию. Метод использует бактериофаги, то есть вирусы, которые заражают бактерии. Фаги размножаются в сосудах с постоянно обновляемой бактериальной культурой. Продолжить размножение могут только вирусы, несущие белок с нужным свойством. Неудачные варианты постепенно исчезают, а полезные мутации переходят в следующие поколения.
PACE проводит десятки циклов эволюции за сутки почти без вмешательства человека. Ранее с помощью системы удалось улучшить прайм-редакторы генома, ферменты для точного воздействия на РНК, фрагменты терапевтических антител и компактные белковые инструменты для редактирования генов . Однако почти все успешные эксперименты начинались с природных белков, которые плохо выдерживали глубокую перестройку.
Причина скрывается в устройстве фермента. Белок связывается с мишенью, или субстратом, благодаря точному совпадению формы и химических свойств. Активный центр распознаёт нужный участок, удерживает молекулу и запускает реакцию. Чтобы фермент освоил новую задачу, мутации должны изменить активный центр или окружающие аминокислоты. Вместе с полезными свойствами возрастает риск деформировать всю молекулу.
Белок может перестать правильно сворачиваться, потерять растворимость и собраться в агрегаты. Иногда структура сохраняется, но страдает избирательность. Фермент начинает работать с новой мишенью, однако продолжает разрезать прежний субстрат или задевает похожие белки. Для лечебных инструментов подобная побочная активность способна свести на нет пользу от новой функции.
Существующие способы защиты усложняют работу. В клетки добавляют белки-шапероны, которые помогают другим белкам принимать правильную форму и смягчают последствия вредных мутаций. Метод работает не всегда и добавляет новые переменные в и без того сложный эксперимент. Другой путь требует сначала отдельно повысить устойчивость природного фермента, а затем заново запустить отбор нужной функции. Дополнительный этап растягивает работу и увеличивает расходы.
ProteinMPNN позволила укрепить фермент до начала лабораторной эволюции. После обработки моделью протеазы прошли отбор в PACE. Перед системой поставили новую задачу: научить молекулярные ножницы разрезать изменённый участок белка, связанного со здоровьем нейронов.
При некоторых нейродегенеративных заболеваниях, включая боковой амиотрофический склероз, в белковой цепи разрастается повторяющийся фрагмент. Молекулы начинают слипаться, образуют токсичные скопления и постепенно повреждают нервные клетки. Мутантный белок давно привлекает внимание как возможная терапевтическая мишень, но природные ферменты плохо разрезают опасный участок до появления агрегатов.
Протеазы, выросшие из созданных ProteinMPNN вариантов, справились заметно лучше. Лучшие ферменты почти в 80 раз эффективнее расщепляли целевой белок и более чем в 56 раз точнее выбирали нужный участок. Они гораздо реже возвращались к первоначальным мишеням ботулинической протеазы.
Преимущество проявилось не в одном удачном опыте. Исследователи проверили три разновидности ботулинического нейротоксина и несколько субстратов. Во всех сериях белки, укреплённые искусственным интеллектом, чаще давали стабильные, активные и избирательные ферменты после направленной эволюции.
Математический анализ показал, почему результат оказался настолько заметным. Переработанные белки выдерживали больше мутаций и продолжали сохранять рабочую форму. Лабораторная эволюция могла свободнее менять активный центр, не разрушая всю молекулу. Природные протеазы быстрее доходили до границы, за которой очередная полезная мутация одновременно лишала белок устойчивости.
Более прочный фермент получает дополнительный запас для перестройки. Часть стабильности можно потерять во время поиска новой функции, не превратив белок в бесполезный агрегат. Чем больше запас, тем сильнее направленная эволюция способна изменить взаимодействие с мишенью.
Подход может расширить набор белков, доступных для инженерной переделки. Сейчас работа часто начинается с природного фермента, который уже умеет хотя бы слабо связываться с нужным субстратом. Для многих мишеней подходящих молекул в природе не найдено. Предварительное укрепление структуры позволяет проводить более глубокие изменения и искать функции, которых у природных белков никогда не было.
Эксперименты проводили на иммортализованных человеческих клетках, способных долго размножаться в лаборатории. Клеточная культура позволила проверить активность и избирательность протеаз, но не воспроизводит устройство ткани или целого организма. Пока неизвестно, сохранят ли новые ферменты эффективность в более сложной среде, смогут ли добраться до нужных клеток и не вызовут ли нежелательных реакций.
Исследователи уже пробуют тот же подход на прайм-редакторах и других молекулярных инструментах. Работа показывает, насколько важен белок, с которого начинается направленная эволюция. Устойчивая исходная молекула выдерживает больше мутаций и открывает путь к функциям, до которых природный фермент просто не смог бы эволюционировать в лаборатории.